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三线定量胶体金免疫亲和试纸法定量中药饮片

  • 来源:本站原创
  • 时间:2021/12/26 0:29:11
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《中草药》校庆专刊文章推送

摘要

目的利用三线胶体金侧流向免疫色谱技术,针对中药特点对样品前处理和检测曲线进行研究,建立快速、准确的定量测定中药饮片中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2总量的方法,迅速检测中药饮片中黄曲霉毒素的污染程度。方法利用胶体金免疫亲和法建立《中国药典》年版规定限度的24种中药饮片中黄曲霉毒素测定方法,进行方法学验证,并对60种中药饮片,共计批次样品进行分类测定。同时利用液质联用(三重四级杆质谱法)对上述样品进行定量检测,并比对2种检测方法。采用配对t检验法比较2种方法的检测结果是否存在显著性差异;通过加入其他真菌毒素对试纸条的特异性进行考察。

真菌毒素污染被世界卫生组织列为食源性疾病的重要根源,其中黄曲霉毒素的危害最大[1-3]。黄曲霉毒素(aflatoxins,AFTs)是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的次生代谢产物,是一类化学结构类似的化合物,均为二氢呋喃香豆素的衍生物,以黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1,AFB1)、黄曲霉毒素B2(aflatoxinB2,AFB2)、黄曲霉毒素G1(aflatoxinG1,AFG1)、黄曲霉毒素G2(aflatoxinG2,AFG2)的危害和毒性最大[4-5]。年AFTs被世界卫生组织的癌症研究机构划定为I类致癌物[6]。AFTs是一类毒性极强的物质,其毒性相当于氰化钾的10倍、砒霜的68倍,可引起肝脏的急慢性损害,同时还对肾脏等其他多种组织器官造成严重损害,并具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用[7-10]。因此各国相继制定了食品中AFTs限量的法规,以保护健康[11-15]。

为了加强中药材的质量控制,国家食品药品监督管理局增加了中药材的安全性指标控制项目,尤其是加强对中药材中AFTs的控制,《中国药典》年版中增加了AFTs的检查方法,并针对24种中药材及饮片开展AFTs检查,并明确规定了AFB1的限量不得超过5μg/kg、AFTs总量(以AFB1、AFB2、AFG1、AFG2总量计)的限量标准为10μg/kg[16]。

目前,AFTs的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)[17-26]和酶联免疫吸附法(ELISA)[27]。液相色谱质谱联用法,尤其是三重四极杆质谱检测器具有灵敏度高、特异性强、选择性好、抗基质背景干扰能力强等特点,多用于复杂基质的检测[28-33],其目前也被《中国药典》年版四部AFTs检查法作为仲裁的验证法应用[16]。《中国药典》中规定的仪器检测方法虽然准确,但标准检验方法,前处理复杂,液相及质谱法检测仪器昂贵,饮片生产经营企业检测均有一定的困难,无法满足廉价、快速现场检测的要求。在检测黄曲霉菌技术的发展中还有胶体金免疫色谱法、毛细管电泳法、生物传感器法、荧光免疫分析荧光偏振免疫分析法、膜基质免疫分析法、免疫芯片检测法等[34-35]。胶体金技术检测AFTs的方法具有快速、简便、低毒等优势,近年来开始应用于粮食饲料领域[36-39],其不仅能够检测粮油、饲料、水稻以及玉米等谷物中AFB1、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1等微生物毒素,还检测牛奶中三聚氰胺、水产品中氯霉素和硝基呋喃代谢物等非法添加剂、食物中副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌以及农药重金属的残留[40-41]。但是中药中胶体金快速检测受到基质干扰问题非常大。根据研究发现不同的中药基质AFT污染差异性较大,中药材柏子仁与薏苡仁本身所含有的成分可以为霉菌的生长提供充足的养分,产毒真菌在这2种油脂与淀粉类基质中容易大量繁殖,导致AFT污染率高[42];大枣等提取液较黏的样品,存在糖、黏液质和大分子蛋白等基质的干扰;陈皮、使君子、槟榔、蜈蚣等色素干扰较大的样品都会产生假阳性。所以亟需建立适用于中药检测的特殊前处理方式及结果矫正曲线等新的胶体金AFTs检测方法研究。

胶体金技术又称侧流向免疫色谱技术,是以胶体金作为示踪标记物应用于样品中待测物检测的一种免疫检测技术,可用于样品中待测物质的快速定性或定量检测,是一种稳定、灵敏的检测方法[43-45]。其反应原理为试样提取液中的AFTs与检测条中的胶体金微粒发生反应,AFTs与胶体金微粒的结合物以及游离的胶体金微粒在侧流作用下移动,当到达检测线时,包被的抗原与游离胶体金微粒结合,胶体金微粒富集后呈现红色,其颜色深浅与试样中AFTs的含量相关。用配套读数仪测定检测条上检测线和质控线颜色深浅,根据颜色深浅和读数仪内置标准曲线计算出试样中AFTs的含量[46-47],通常只能进行定性检测,无法准确定量;而市场上少数可用于定量测定的二线试纸存在无法抗基质背景干扰而出现假阳性率高、定量曲线不稳定、且检测范围较窄,无法稀释后检测等问题。而本方法中使用的AFTs定量检测条,则针对这一情况在技术上做了改进,增加了一条检测线,形成三线定量检测条,即包括2条检测线和1条质控线,同时使用读数仪,实现待测样品的准确定量。三线定量检测条的意义在于可以增加定量结果的准确性和稳定性,同时能够增加定量检测的范围,检测范围较其他胶体金检测条更宽。

此外与传统食品检测不同,中药的基质背景复杂,色素黏液质及中药中不同有效成分(如黄酮类、蒽醌类、菲醌类化合物等)都会给胶体金检测带来不同程度的影响。根据此情况,研发出几种不同的前处理方法,分别解决此问题,以使胶体金可以作为一种中药AFTs通用的检测方法。并且针对中药基质背景干扰的问题,重新对内部工作曲线进行矫正,针对中药精确度要求高,含量范围大等特点本研究开发了3个读数曲线进行低、中、高3个质量浓度的检测。该研究利用竞争法原理,在传统免疫分析的基础上引入胶体金快速检测方法,发展出AFTs胶体金免疫快速定量检测技术。该方法实现了简单、灵敏、准确、快捷、低毒等优点,10~30min完成前处理,10min内可完成1~4个样品的定量检测,顺应了快速检测的发展方向。

1仪器与材料

1.1仪器与试剂

ROSA定量读数仪、ROSA45℃恒温孵育器、黄曲霉毒素全封闭三线定量检测条、黄曲霉毒素B1全封闭三线定量检测条购自北京中检葆泰生物技术有限公司;IKAA11basic中药粉碎机、VORTEX2涡旋振荡仪,购自德国IKA公司;XPE千分之一分析天平,购自德国赛多利斯公司;DT5-2B离心机,购自北京时代北利离心机有限公司;实验用水为高纯水,甲醇、乙腈均为色谱纯。

赛默飞世尔超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪(UHPLC-TSQQuantum),美国赛默飞世尔公司,配有二极管阵列检测器(PDA)、电喷雾离子源(ESI)、Xcalibur工作站等。

1.2样品与对照品

共收集河北、安徽、江苏、云南、天津、重庆、北京等省市的市售远志、大枣、使君子、麦芽、柏子仁、莲子、桃仁、酸枣仁、薏苡仁、槟榔、僵蚕、全蝎、水蛭、肉豆蔻、陈皮、地龙、胖大海、决明子、蜈蚣、蜂房、九香虫、延胡索、土鳖虫、马钱子等60种中药饮片样品,每个品种2个批次。共计个批次。经北京市药检所杜小伟主管药师鉴定均为正品,具体信息见表1。

对照品AFTB1(批号LA)、AFTB2(批号LB)、AFTG1(批号LC)、AFTG2(批号LA)、AFTM1(批号LM)、AFTM2(批号1I00F12)、伏马毒素B1(批号LF)、赭曲霉毒素A(批号LA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(批号1I00F04)、玉米赤霉烯酮(批号LZ),以上对照品质量分数均≥98%,均购自美国Supelco公司。

2方法

2.1样品准备

参照《中国药典》年版药材和样品取样法(通则)进行取样。取代表性的样品50g,用粉碎机将样品粉碎至全部通过二号筛,充分混合均匀。

2.2供试品溶液的制备

2.2.1样品提取方法1远志、大枣、使君子、麦芽、柏子仁、莲子、桃仁、酸枣仁、薏苡仁、僵蚕、水蛭、全蝎、巴戟天、人参、太子参、红参、红花、何首乌、蒲公英、甘草片、牛膝、板蓝根、黄芪、法半夏、泽泻、淡豆豉、延胡索、椒目、六神曲、神曲。

取代表性均匀粉末(过二号筛)样品,精密称取样品2g至离心管中;加入4mL(远志、大枣、使君子、麦芽、柏子仁、莲子、桃仁、酸枣仁、薏苡仁、僵蚕、水蛭、全蝎、巴戟天、人参、太子参、红参、红花、何首乌、牛膝、板蓝根、法半夏、泽泻、淡豆豉、延胡索、椒目、六神曲、神曲)或6mL(蒲公英、甘草片、黄芪)70%甲醇,涡旋振荡2min;r/min离心10min(离心后的样品在2h内使用);精密量取μL离心后的上清液至含有1.0mL黄曲霉稀释缓冲液的离心管中,作为供试品溶液(样品上清液加入稀释缓冲液中如果有沉淀,可充分混匀后进行离心,取离心后上清液检测)。

2.2.2样品提取方法2肉豆蔻、胖大海、地龙、栀子、三七、鱼腥草、车前草、焦神曲、金银花、炒白术、蜂房、土鳖虫、玉竹、九香虫、白茅根、知母、白花蛇舌草、茯苓、枳壳、马钱子、炒枳壳。

取代表性均匀粉末(过二号筛)样品,精密称取样品2g至离心管中;加入4mL(肉豆蔻、胖大海、栀子、三七、焦神曲、金银花、炒白术、蜂房、土鳖虫、玉竹、九香虫、白茅根、知母、白花蛇舌草、茯苓、枳壳、马钱子、炒枳壳)或6mL(地龙、车前草)或8mL(鱼腥草)甲醇(可根据样品特性加大提取液比例),涡旋振荡2min;r/min离心10min(离心后的样品在2h内使用);精密量取μL离心后的上清液至含有1.0mL黄曲霉的稀释缓冲液(聚山梨酯20-磷酸盐缓冲液)的离心管中,充分混匀,00r/min离心5min,作为供试品溶液(样品上清液加入稀释缓冲液中如果有沉淀,可充分混匀后进行离心,取离心后上清液检测)。

2.2.3样品提取方法3决明子、蜈蚣、银杏叶、陈皮、虎杖、槟榔。

取代表性均匀粉末(过二号筛)样品,精密称取样品2g至离心管中;加入4mL甲醇溶液,涡旋振荡2min;r/min离心10min;取上清液过NH2键合硅胶(mg/3mL)萃取小柱,收集滤液;精密量取μL滤液至含有1.0mL黄曲霉稀释缓冲液的离心管中,充分混匀,作为供试品溶液(样品上清液加入稀释缓冲液中如果有沉淀,可充分混匀后进行离心,取离心后上清液检测)。

2.2.4样品提取方法4大黄、大青叶、黄连。

取代表性均匀粉末(过二号筛)样品,精密称取样品2g至离心管中;加入10mL85%乙腈溶液,涡旋振荡2min;r/min离心10min;取上清液过NH2键合硅胶固相萃取柱(mg/3mL),收集滤液;精密量取2.5mL滤液,用20mL水进行稀释,混匀稀释液;移取醇活化C18固相萃取柱(mg/3mL)(3mL甲醇及3mL水分别淋洗小柱使活化),把混匀后的稀释液全部过活化过的C18固相萃取柱,然后用5mL水淋洗柱子;用1mL甲醇洗脱C18固相萃取柱,收集洗脱液;精密量取μL洗脱液至含有1mL黄曲霉稀释缓冲液的离心管中,充分混匀,此为一次稀释液,用于检测。

2.3供试品溶液稀释液的制备

如果供试品溶液质量分数超过30ng/g需要进行二次稀释:精密量吸取“2.2”项方法制备的供试品溶液μL至含有1.0mL黄曲霉稀释缓冲液的离心管中,充分混匀,作为供试品溶液稀释液。

2.4胶体金免疫色谱方法定量检测

取ROSA黄曲霉毒素定量检测条和AFTs稀释缓冲液,恢复至室温(20~25℃);孵育器温度(45±1)℃。缓慢移取μL稀释的提取液检测条样品室中。孵育5min,孵育结束后,取出检测试纸条放至室温下,水平放置10min。将检测试纸条插入读数仪。选择对应频道,选择相应的AFTs读数,读取结果。该方法的检测范围为0~μg/kg,共3个读数频道。频道1读取质量分数低于10ng/g的样品,灵敏度为0.01ng/g;频道2读取质量分数10~30ng/g的样品,灵敏度为1ng/g;频道3读取质量分数为30~ng/g的样品,灵敏度为1ng/g。

2.5液质联用色谱仪(LC/MS-MS)比对检测实验方法

2.5.1供试品溶液的制备

取供试品粉末约15g(过二号筛),精密称定,置于均质瓶中,加入氯化钠3g,精密加入70%甲醇溶液75mL,高速搅拌2min(搅拌速度大于10r/min),离心5min(离心转速2r/min),精密量取上清液15mL,置50mL量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,量取续滤液20.0mL,通过免疫亲和柱,体积流量3mL/min,用水20mL洗脱,洗脱液弃去,使空气进入柱子,将水挤出柱子,再用适量甲醇洗脱,收集洗脱液,置2mL量瓶中,并用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。

2.5.2色谱、质谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相为10mmol/L醋酸铵水溶液-甲醇,梯度洗脱:0~4.5min,35%~85%乙腈;4.5~6.0min,85%~%乙腈;6.0~6.5min,%~35%乙腈;6.5~10.0min,35%乙腈;柱温25℃;体积流量0.3mL/min。

以三重四极杆串联质谱仪检测;电喷雾离子源(ESI),釆集模式为正离子模式;各化合物监测离子对和碰撞电压(CE)见表2。

2.5.3系列混合对照品溶液的制备

精密量取AFTs

混合对照品溶液(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的标示质量浓度分别为1.0、0.3、1.0、0.3μg/mL)适量,用70%甲醇稀释成含AFB2、AFG2质量浓度分别为0.03、0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92、2.88ng/mL,含AFB1、AFG1质量浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、3.2、6.4、9.6ng/mL的系列对照品溶液,即得。参照《中国药典》年版四部通则AFTs测定法第二法进行检测。

3结果与分析

3.1方法专属性

胶体金侧流向免疫色谱快速定量检测方法特异性实验。

3.1.1AFB1特异性验证实验

选取空白70%甲醇(平行6份),莲子、薏苡仁、地龙、酸枣仁阴性样品(平行2份),加入AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混合对照品溶液(质量分数分别为5、20、50μg/kg)、AFM1对照品溶液(质量分数为30μg/kg)、AFM2对照品溶液(质量分数为30μg/kg)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇对照品溶液(质量分数为30μg/kg)、玉米赤霉烯酮对照品溶液(质量分数为30μg/kg)、伏马毒素B1对照品溶液(质量分数为30μg/kg)、赭曲霉毒素A对照品溶液(质量分数为30μg/kg),除添加AFTs对照品的样品可以检测出AFTs外,其余添加样品测定结果均为阴性,结果见表3。

3.1.2AFTs总量特异性验证实验

选取空白70%甲醇(平行6份),莲子、薏苡仁、地龙、酸枣仁阴性样品(平行2份),加入AFB1对照品溶液(质量分数分别为5、20、50μg/kg),AFB2、AFG1、AFG2混合对照品溶液(质量分数为30μg/kg),AFM1对照品溶液(质量分数为30μg/kg)、AFM2对照品溶液(质量分数为30μg/kg)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇对照品溶液(质量分数为30μg/kg)、玉米赤霉烯酮对照品溶液(质量分数为30μg/kg)、伏马毒素B1对照品溶液(质量分数为30μg/kg),赭曲霉毒素A对照品溶液(质量分数为30μg/kg),除添加AFTs对照品的样品可以检测出AFTs外,其余添加样品测定结果均为阴性,结果见表4。

3.2胶体金侧流向免疫色谱快速定量检测方法稳定性实验

将空白样品进行加标,目标质量分数分别为

2.5、5、8、10、50、80、μg/kg。分别做6个平行,置于室温下[48]进行样品检测。经系列数据分析发现,实验孵育结束后,将胶体金条水平放置10min,可以观察到胶体金条的检测线和质控线显色清晰,且稳定性检测结果RSD<5%,说明放置10min读数检测方法的稳定性良好。检测结果见表5。

3.3加样回收率试验

3.3.1AFB1

取样品2.0g,共9份,根据不同样品本底的结果,选择低、中、高3水平分别添加对照品总质量分数为5、20、50μg/kg的对照品,每个加标水平平行3份,按“2.2”项方法制备供试品溶液并测定,计算各加样水平样品的加样回收率和RSD,结果见表6。结果表明,加样回收率为80.3%~.7%,RSD为0.1%~9.9%。

3.3.2AFTs总量

取样品2.0g,共9份,根据不同样品本底的结果,选择低、中、高3水平分别添加对照品AFB1质量浓度为5、10、50μg/kg的对照品,每个加标水平平行3份,按“2.2”项方法制备供试品溶液并测定,计算各回收率和相对标准偏差,结果见表6。结果表明,加样回收率为80.6%~.6%,RSD为0.4%~13.2%。

3.4实际样品的检测

3.4.1样品的AFB1检测

按照上述供试品溶液制备方法,进行实际样品检测。批次样品中,AFB1的检出率为97.5%,但是检测结果都低于5μg/kg的限度。结果见表7。

3.4.2样品的黄曲霉总量的检测

检测按照上述供试品溶液制备方法,进行实际样品检测。批次样品中,AFTs总量的检出率为90.8%。98.3%样品低于10μg/kg的限度,有2个批次超出,为远志样品。结果见表7。

3.5胶体金侧流向免疫色谱快速定量检测方法准确性实验

3.5.1AFB1三线胶体金快速定量法与LC/MS-MS标准方法

分别对60种阳性样品进行检测,采用配对t检验法比较2种方法的检测结果是否存在显著性差异。经计算,t值为0.,自由度为59,P>0.05,说明胶体金快速定量检测方法与药典中LC/MS-MS标准方法之间无显著性差异。结果见表7。

3.5.2AFTs总量

三线胶体金快速定量法与LC/MS-MS标准方法分别对60种中药饮片的61批次样品(其中远志样品为2批次)进行平行比对检测,采用配对t检验法比较2种方法的检测结果是否存在显著性差异。经计算T值为?0.,自由度为59,P>0.05,说明三线胶体金快速定量检测方法与药典中LC/MS-MS标准方法之间无显著性差异。

结果见表7。

4讨论

本研究对60种不同种类中药饮片建立了三线胶体金侧流向免疫色谱检测AFB1及AFB1、AFB2、AFG1、AFG2总量方法,同时进行分类测定方法,对该本方法的稳定性、特异性、准确度以及加标回收率进行评价,同时跟药典LC/MS-MS标准方法进行比对,差异较小。

经系列数据分析发现,实验孵育结束后将胶体金条水平放置10min读数可以观察到胶体金条的检测线和质控线显色清晰,且稳定性检测结果良好。

试验样品中,多数检测出AFTs,AFB1的检出率为90.8%,AFTs总量的检出率为97.5%。样品中有2个批次AFTs总量超出10μg/kg的限度,均为远志样品。除与储藏运输等条件有关,也与远志特殊的炮制方法以及非产地加工等原因有关,在外源性安全控制中应加以注意。

研究结果可以看出,本方法的检测结果和药典LC/MS-MS标准方法结果相吻合,AFB1和总量2种方法的线性关系r值为0.与0.。配对t检验法表明胶体金快速定量检测方法与药典中LC/MS-MS标准方法之间无显著性差异。加标呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素和赭曲霉毒素,检测结果都显示未检出,特异性好,与其他真菌毒素没有交叉反应,加样回收率为80.3%~.7%。

与LC/MS-MS方法相比,三线胶体金试剂条检测法单、快捷,10min内可完成1~4个样品的定量检测,顺应了快速检测的发展方向。同时操作简单,无需专业人员培训,检测成本低,在医院、药店、中药材及饮片企业以及药材采购环节的实际工作中,无需特殊仪器设备和试剂,可以大批量检测中药材及中药饮片中AFTs,极大的提高工作效率,具有较高的应用价值[49]。并且操作过程无需使用毒素对照品溶液,满足各种检测的需求,整个操作过程对环境无污染,对于检测人员的健康起到最大程度的保护。

本研究建立适用于中药检测的特殊前处理方式、结果矫正曲线等新的方法研究,并为中药行业定量控制AFTs,制定一种低毒快速环保的测定方法及相关标准具有很大意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献:(略)

来源:范妙璇,傅欣彤,陈奕菲,陈思妮,陈晶,张婷,陈有根.三线定量胶体金免疫亲和试纸法定量中药饮片中黄曲霉毒素B1及B1、B2、G1、G2总量的研究[J].中草药,,52(17):-

设计:毛良潇

校对:胡燕

审核:张伟

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本文编辑:佚名
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